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文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

無細胞蛋白質合成系統(tǒng)（The cell－free protein synthesis system，CFPS）是一種以外源mRNA或DNA為模板，在細胞抽提物的酶系中補充底物和能量來合成蛋白質的體外系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的體內重組表達系統(tǒng)相比，體外無細胞合成系統(tǒng)具有多種優(yōu)點，例如：步驟相對簡單、可表達對細胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D－氨基酸）的特殊蛋白質、能夠直接以PCR產物作為模板同時平行合成多種蛋白質、便于開展高通量藥物篩選和蛋白質組學的研究……等。

細胞與無細胞蛋白質合成系統(tǒng)的比較（Khambhati K，  et al．  Frontiersin Bioengineering and Biotechnology， 2019， ）

2020年6月，美國加利福尼亞大學Luis E． Contreras－Llano等人在《Nature Communications 》（IF＝14．919）雜志上發(fā)表了題為“Holistic engineering of cell－free systems through proteome－reprogramming synthetic circuits”的文章，本文章研究強調了整體合成生物學方法在提高局部合成模塊性能方面的實用性和潛力，證明了重組蛋白質是宿主細胞中翻譯機制過度表達的直接結果。此外，還表明了在源菌株中使用質粒系統(tǒng)不會導致無細胞蛋白質合成系統(tǒng)（CFPS）的活性降低。

文章中，作者利用合成模塊來表達大腸桿菌核心翻譯機器的全部或子集的34種蛋白質，這些蛋白質被裂解并用于CPFS中的多株大腸桿菌BL21（DE3）中。選擇在多個菌株中進行蛋白質過表達是為了減少蛋白質表達和質粒維護造成的代謝負擔。質粒維護造成的負擔表現(xiàn)為生長速度下降，這反過來又產生了較低濃度的核糖體和其他翻譯機器蛋白。這已被證明是高效CFPS的一個限制因素。作者假設，翻譯機器的過度表達應在兩個方面有利于CFPS。首先，它應該通過提供翻譯因子來補償增加的代謝負擔。其次，它應該將全部蛋白質組轉變到一個類似于高生長率的狀態(tài)，其中翻譯因子被富集，細胞達到蛋白質合成效率的峰值。作者研究了兩個不同的微生物聯(lián)合體，一個有18個菌株（BL－18S），另一個有7個菌株（BL－7S），以獲得富集翻譯機器的細胞裂解物，而不需要純化和補充單個蛋白質。為了研究標準CFPS反應中增加的翻譯因子的影響，作者純化了BL－18S中過表達的翻譯機制蛋白，并將其補充為BL－E。deGFP的表達水平隨著翻譯機制的增加而成比例地增加。這些結果表明，蛋白質濃度的增加并不是導致多菌株CFPS系統(tǒng)蛋白質表達增加的唯一因素。此外，作者還通過質譜分析了幾種全細胞裂解物的蛋白質組成。

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所用到的主要方法

METHODS  

CFPS系統(tǒng)反應

deGFP表達定量分析

半連續(xù)交換反應

質譜分析

透射電子顯微鏡觀

SDS－PAGE

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文章主要內容摘要

ABSTRACT

合成生物學專注于結合宿主細胞操作的基因工程模塊。為增強合成模塊的功能，可以對宿主蛋白質組進行重編程改造。在這里，作者將整體合成生物學的概念應用到無細胞蛋白質合成系統(tǒng)工程中，利用細胞內代謝網(wǎng)絡之間的聯(lián)系，創(chuàng)造一個更有利于蛋白質合成的環(huán)境。具體來說，作者發(fā)現(xiàn)表達翻譯機制的局部模塊可以重新編程細菌蛋白質組，改變700多種蛋白質的表達水平。由此產生的反饋產生了一個無細胞系統(tǒng)，可以合成熒光檢測基因、蛋白質納米膠囊和基因編輯核酸酶Cas9，其表達水平比傳統(tǒng)的無細胞系統(tǒng)高5倍。作者的研究用到了一種整體方法，該方法將合成生物學和系統(tǒng)生物學整合在一起，實現(xiàn)了僅通過局部代謝途徑無法實現(xiàn)的結果。

       原文標題 : 通過蛋白質組重編程，對無細胞合成生物學系統(tǒng)進行整體工程設計