前言

針對免疫檢查點（如PD-1、CTLA-4）癌癥免疫治療的臨床成功開創(chuàng)了癌癥治療的新時代。然而，免疫治療固有的和后天的耐藥性限制了患者的受益和更廣泛的應用。對免疫治療反應和抵抗機制的研究已經(jīng)證實了關鍵的腫瘤內(nèi)在和外在因素，研究多種細胞類型的復雜相互作用對于理解癌癥治療的反應和耐藥性機制十分關鍵。

但是，缺乏能夠真實再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境（TME）關鍵特征的模型系統(tǒng)仍然是癌癥研究者面臨的一個挑戰(zhàn)。近年來，患者源性腫瘤模型的出現(xiàn)，促進了腫瘤免疫動力學的研究。微流控技術使微物理系統(tǒng)（MPS）的發(fā)展成為可能，用于評估腫瘤微環(huán)境，在研究腫瘤免疫動力學方面顯示出良好的應用前景。進一步開發(fā)基于微流控的“芯片上腫瘤”的MPS來研究腫瘤-免疫相互作用可能會克服目前腫瘤免疫學面臨的幾個關鍵挑戰(zhàn)。

腫瘤微環(huán)境

腫瘤在TME中形成和發(fā)展，TME不僅包含腫瘤細胞，還包含基質細胞和免疫細胞。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展既受腫瘤內(nèi)遺傳或獲得性突變的影響，也受腫瘤周圍TME中多種成分的相互作用的影響，包括細胞、信號因子和支持性結構分子。值得注意的是，腫瘤異質性存在于不同患者之間、同一患者的不同病變內(nèi)以及單個腫瘤的不同區(qū)域。在TME中存在的免疫和基質成分中也觀察到這種異質性。更重要的是，這種異質性隨著時間的推移是動態(tài)的。

腫瘤微環(huán)境是細胞和非細胞成分的高度異質性混合物，包括成纖維細胞、細胞外基質（ECM）、間充質基質/干細胞（MSCs）、血管系統(tǒng)、平滑肌細胞、免疫細胞、神經(jīng)和信號因子。在TME的背景下，隨著單細胞RNA測序、質譜儀和多參數(shù)成像等技術的發(fā)展，分析了TME的復雜性和多樣性及其對治療反應的影響。

根據(jù)免疫成分和狀態(tài)，TME被分為三種類型，包括浸潤-排斥、浸潤-炎癥和浸潤-三級淋巴結構（TLS）。浸潤-排斥TME的特征是細胞毒性T細胞（CTL）排斥在腫瘤核心外，CTL定位于腫瘤周圍。浸潤-炎癥TME的特征是腫瘤細胞和髓系細胞上大量表達PD-L1，CTL高度激活，表達顆粒酶B、IFN-γ和PD-1。浸潤-TLSTME含有TLS，其免疫細胞成分與淋巴結類似，包括B細胞、樹突狀細胞和Treg細胞。

最近，通過分析20種不同癌癥中10000多名癌癥患者的轉錄組信息，Bagaev等人確定了四種TME亞型：免疫富集型和纖維化型（IE/F）、免疫富集型和非纖維化型（IE）、纖維化型（F）和免疫耗竭型（D）。IE/F亞型為免疫性炎癥，以CAF激活和血管生成相關功能基因表達上調為特征。IE亞型高度浸潤，顯示T細胞活性增加。F和D亞型均缺乏或僅有少量淋巴細胞浸潤。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些TME亞型與免疫治療的反應相關，其中具有良好免疫微環(huán)境的患者往往從免疫治療中獲益最多。

腫瘤微環(huán)境建模

TME中復雜的細胞相互作用影響對癌癥治療的反應和耐藥性。開發(fā)更復雜和臨床相關的TME模型不僅可以提供一種可靠的方法來評估新治療方案的療效，還可以促進我們對腫瘤細胞和TME之間相互作用的理解，從而進一步促進有效抗癌策略的識別。隨著生物工程和動物模型的發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出多種復雜的體內(nèi)、二維和三維癌癥模型。

體內(nèi)模型

小鼠模型可以提供一個完整的先天性和適應性免疫系統(tǒng)，允許在TME的影響下開發(fā)來自同基因移植或基因工程的腫瘤。同基因植入小鼠腫瘤模型仍然是研究TME和評估免疫療法的“金標準”。通過將自發(fā)的、致癌物誘導的或轉基因的腫瘤細胞系接種到近交系，如C57BL/6、BALB/c和FVB小鼠，同基因小鼠發(fā)展出與宿主免疫系統(tǒng)相互作用并成為免疫浸潤的腫瘤。

鑒于觀察到的人類和小鼠腫瘤之間的差異，研究人員開發(fā)了人源化小鼠模型，用匹配的人類腫瘤細胞和免疫細胞在免疫缺陷宿主小鼠中重建人類腫瘤-免疫系統(tǒng)。這些人源化小鼠為研究腫瘤-免疫細胞相互作用和評估免疫治療反應提供了一個有好的臨床前模型。然而，它們需要自體免疫重建，并且免疫重建的持續(xù)時間相對較短，限制了它們的廣泛應用。盡管這些模型并不完美，但它們已經(jīng)在評估植入人體腫瘤組織的治療效果方面取得了巨大進展。

二維培養(yǎng)模型

基于永生化細胞系的傳統(tǒng)2D培養(yǎng)系統(tǒng)由于其低成本和高通量的能力，已被癌癥生物學家廣泛用于研究腫瘤生物學和測試抗癌療法，尤其是研究作用機制。

然而，當從腫瘤塊中分離細胞，然后在2D條件下（塑料瓶或培養(yǎng)皿）培養(yǎng)時，細胞失去了細胞-細胞和細胞-細胞外環(huán)境的相互作用，這對其生理功能至關重要，如細胞分化、基因表達和對刺激的反應。此外，細胞形態(tài)和細胞極性也會發(fā)生變化。

2D培養(yǎng)系統(tǒng)的另一個缺點是缺乏腫瘤微環(huán)境的復雜性和異質性，使其成為研究復雜癌癥生物學和試驗臨床前藥物的較不可靠的模型系統(tǒng)。

三維培養(yǎng)模型

3D腫瘤模型越來越多地用于更真實地再現(xiàn)體內(nèi)觀察到的生物學。3D腫瘤模型開發(fā)的核心是3D培養(yǎng)設備和生物材料，作為腫瘤細胞、球體或類有機物生存和生長的支架。大多數(shù)3D腫瘤模型使用從動物或植物中純化的天然生物材料，這些材料可以被腫瘤和/或基質細胞酶消化。3D腫瘤模型中常用的天然生物材料包括膠原蛋白、明膠、基質凝膠、水凝膠、殼聚糖、海藻酸鈉、蠶絲、聚ε-己內(nèi)酯（PCL）和透明質酸。這些生物材料可單獨使用或組合使用，并應用于培養(yǎng)細胞或球體。

通過集成3D培養(yǎng)系統(tǒng)和生物材料，已經(jīng)開發(fā)出多種3D培養(yǎng)模型，包括球體、類器官和3D生物打印，并應用于各種類型的癌癥。多細胞腫瘤球體（MTS）由多個自組裝成3D球形結構的癌細胞組成。因此，它們可以在3D環(huán)境中捕捉細胞相互作用，并可以維持特定的細胞形態(tài)，以及模擬類似于體內(nèi)條件的代謝和增殖梯度。

類器官是通常由干細胞或祖細胞產(chǎn)生的3D細胞簇，嵌入細胞外基質中，自發(fā)形成器官樣或組織樣結構。它們可以擴展用于長期培養(yǎng)，保存原始組織的組織學和遺傳特征，并且可以進行冷凍保存以促進長期的反復實驗。由于類器官也易于遺傳操作，基于類器官的3D腫瘤模型已廣泛應用于許多領域，包括癌癥研究。

3D生物打印是一種創(chuàng)新的計算機輔助工程技術，可在生理3D模型中生成包含多種細胞類型的3D組織結構。它可以有效地重現(xiàn)TME的關鍵成分，并且適合于高通量篩選或測試各種癌癥模型中的藥物療效。

3D培養(yǎng)為評估藥物療效提供了一個更具生理相關性的環(huán)境，也為篩選潛在藥物靶點提供了一個理想的系統(tǒng)。然而，必須強調的是，選擇的平臺通常由感興趣的特定過程決定，并且特定于模型的特性可能會影響結果，因此需要進行跨模型驗證。

微流控技術

微流控技術是一種可以操縱在數(shù)百毫米長度的通道中的微小流體（10−9至10−18 L）的技術。由于TME內(nèi)的腫瘤細胞和免疫細胞的細胞體積與細胞外液體積大于1（即細胞外液體積更�。�，微流控裝置的尺寸使其非常適合用于研究和模擬TME的生物學應用。微流控技術的另一個特點是其低雷諾系數(shù)（Re），這是指流體上慣性力與粘性力的比率。當Re值較低時，微流控系統(tǒng)中的流體流動為層流，這意味著質量主要通過擴散傳遞。這使得在微流控系統(tǒng)中在時間和空間上產(chǎn)生可溶性因子的濃度梯度成為可能。

微流控裝置也被稱為“器官芯片”或“組織芯片”，使用塑料材料或其他光學透明材料形成灌流空心微通道，可以模擬脈管系統(tǒng)。雖然聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常用于制造微流控裝置，但已經(jīng)驗證了幾種剛性熱塑性聚合物（例如聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物），以克服PDMS的關鍵限制，例如疏水分子的吸附和蒸發(fā)。此外，隨著微流控技術的發(fā)展和人們對該系統(tǒng)的優(yōu)化，許多復雜的微流控設備已被開發(fā)用于特定功能。

微流控技術在腫瘤免疫的應用

通過將微流控技術與3D培養(yǎng)系統(tǒng)相結合，研究人員可以控制基質結構、基質剛度、細胞組成和比率、流速和其他特征。這些設備還可以與高分辨率實時成像結合，以探索特定器官或疾病背景下的各種臨床前分析。微流控技術已廣泛應用于癌癥生物學和癌癥免疫治療的許多方面的研究，包括腫瘤生長、癌細胞外滲、血管生成、免疫治療反應和藥物篩選。

腫瘤生長

癌細胞的標志性特征之一是持續(xù)的增殖信號，導致細胞生長失控。3D微流控設備已被用于探索TME中不同細胞亞型和影響癌細胞增殖的因素之間的相互作用。

為了研究成纖維細胞和ECM蛋白對癌細胞生長和遷移的影響，Lugo Cintroón等人在微流控裝置中將乳腺癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞通過增加培養(yǎng)基中金屬蛋白酶（MMPs）的水平促進癌細胞生長并誘導更多的遷移。

腫瘤遷移和外滲

癌細胞外滲是循環(huán)中的腫瘤細胞通過血管在次要部位形成沉積的過程。微流控建模能夠評估腫瘤細胞/內(nèi)皮細胞的遷移和腫瘤細胞的外滲。與研究細胞遷移的傳統(tǒng)方法（如transwell分析和劃痕分析）相比，這種基于微流控的平臺在介質通道中使用內(nèi)皮細胞單層來模擬微血管，提供更具生理相關性的微環(huán)境，以研究癌癥-血管串擾，并確定參與腫瘤細胞遷移潛能調節(jié)的因素。利用這項技術，發(fā)現(xiàn)了幾種細胞因子，如IL-6、IL-8和MMP-3分泌水平的增加與外滲呈正相關。

血管生成

血管生成對腫瘤生長特別重要。已經(jīng)開發(fā)了多種基于微流控的血管生成模型，以模擬體外新血管形成的起始。其中一項研究證明了在微流控裝置中重建血管生成芽，以及如何應用該模型來確定潛在血管生成抑制劑對體外芽形成的影響。

腫瘤轉移

轉移是一個復雜的過程，因此，研究癌癥進展中這一關鍵步驟的潛在機制非常重要。Cho等人開發(fā)了一種具有淋巴管-組織-血管結構的三通道微流控裝置，以研究炎癥細胞因子在淋巴轉移中的作用，并發(fā)現(xiàn)IL-6通過介導TME中的細胞間相互作用誘導上皮-間充質轉化。

TME建模

忠實地再現(xiàn)TME關鍵成分的腫瘤模型可促進預測癌癥治療敏感性的應用，為個性化或精準治療策略鋪平道路。微流控設備是此類應用的理想選擇，因為TME中的多個組件可以單獨控制。

例如，Jeong等人展示了一種微流控芯片，該芯片允許腫瘤球體與CAF共同培養(yǎng)，以監(jiān)測其相互作用，為研究腫瘤細胞與CAF的串擾提供了一個平臺。另一種類似的方法已被用于模擬腫瘤細胞與基質的相互作用，以及腫瘤與內(nèi)皮細胞之間的相互作用。

此外，還開發(fā)了微流控裝置來模擬TME的其他功能。例如，Michna等人描述了一種包含互連微通道的新平臺，以模擬高度血管化系統(tǒng)。其他研究還側重于開發(fā)微流控芯片以控制氧濃度。

免疫細胞遷移/招募

模擬免疫細胞遷移對于理解腫瘤-免疫動態(tài)相互作用和免疫治療反應至關重要。通過集成顯微技術，可以實時監(jiān)測微流控芯片模擬的細胞遷移。

許多研究利用微流控技術探索免疫細胞遷移在癌癥發(fā)展中的作用。一項研究證明了含有基于管腔的血管成分的微流控系統(tǒng)用于研究中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用，揭示了IL-8在促進中性粒細胞趨化和啟動中的關鍵作用。招募的中性粒細胞增加了局部活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而促進細胞粘附和趨化因子受體的上調。

T淋巴細胞活化

盡管已采用多種分析方法檢測T細胞活化和效應T細胞功能，但在刺激條件下實時監(jiān)測3D環(huán)境中的T細胞激活更有價值。Park等人使用微流控系統(tǒng)監(jiān)測T細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用，并將其應用于識別可能調節(jié)這種相互作用的潛在藥物。

治療評估

3D微流控技術已用于測試對ICI單獨或與其他方案聯(lián)合的免疫治療反應。為了利用該系統(tǒng)評估免疫治療反應，使用了多種敏感和耐藥的同源模型來驗證該系統(tǒng)的穩(wěn)健功能。

應用這種策略，Deng等人發(fā)現(xiàn)CDK4/6抑制劑和PD-1阻斷劑的組合通過促進T細胞浸潤和活化來提高治療效果。同時，Sade Feldman等人進行了scRNA序列分析，并定義了兩種不同的CD8+T細胞狀態(tài)，即CD8+CD39−TIM3−和CD8+CD39+TIM3+，可作為檢查點免疫治療成功或失敗的預測指標。

疾病和治療反應監(jiān)測

疾病和治療反應監(jiān)測是作出臨床決定和預測所必需的。許多微流控設備已經(jīng)適應了這些領域的功能。目前，CellSearch設計的微流控裝置已獲得FDA批準，用于預測預后，評估患者的無進展生存率和總生存率。該設備利用靶向EpCAM的抗體包被磁粉檢測和量化轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者全血中上皮來源的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）。

除CTC外，一些免疫親和微流控裝置已用于捕獲液體活檢中的外泌體。其中一個來自ExoSearch，利用微流控裝置中的濃縮血漿外泌體，免疫磁珠可用于捕獲和測量外泌體腫瘤標記物（如CA-125、EpCAM和CD24）。由于一些外泌體已被證明會抑制抗腫瘤免疫，因此有希望監(jiān)測外泌體上的免疫治療反應相關標記物（如PD-L1）以預測ICI療效。

藥物篩選

目前，人們對開發(fā)3D腫瘤模型以改進癌癥藥物開發(fā)的興趣越來越大。基于微流控技術的藥物檢測能夠減少所需試劑的體積，并且可以適應并行化和潛在的自動化。

盡管大多數(shù)基于微流控設備的藥物篩選應用都處于概念驗證階段，但有幾個小組已經(jīng)嘗試開發(fā)微流控系統(tǒng)來進行藥物篩選。例如，Bhise等人通過3D打印技術開發(fā)了一個芯片肝臟平臺，使用肝臟球體作為材料源，將肝臟組織直接打印到微流控設備中。作者進一步證明，生物打印的肝球體可以在設備中長期培養(yǎng)，并用作藥物毒性測試平臺。

小結

癌癥治療在過去十年中取得了長足的進步，尤其是靶向治療和免疫治療的應用，但固有和獲得性耐藥性仍然是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)。關于腫瘤和TME的異質性以及腫瘤-免疫相互作用的動態(tài)性質仍然需要進一步研究。 此外，隨著多種聯(lián)合療法、新的生物標記物和抑制性受體被提出來指導我們的診斷、預后和治療方法，需要更復雜的臨床前模型來提供可靠的功能應用和更有效的評估。

微流控設備的使用保持了患者腫瘤準確的生理性和特征，三維培養(yǎng)與微流控技術相結合來模擬腫瘤-免疫動力學以評估藥物療效，有可能減少藥物開發(fā)的時間和成本。此外，微流控設備可以進行多組學研究和實時成像分析，這將有助于研究腫瘤-免疫相互作用和抗藥性機制，以及識別和評估新型癌癥治療方法。綜上所述，腫瘤微環(huán)境的微流控建模有望被納入臨床實踐，以推進癌癥免疫治療和精確醫(yī)學。

參考文獻：

1.Going with the Flow: Modeling the Tumor Microenvironment Using MicrofluidicTechnology. Cancers (Basel). 2021 Dec; 13(23): 6052.

       原文標題 : 腫瘤免疫前沿中的微流控技術