毛細血管后靜脈mTECs上調(diào)了HEV標記（圖S5J和S5K），通過免疫染色證實（圖S6A和S6B）。

圖S6：針對不同靶位的免疫染色的健康鼠肺（左）和鼠肺腫瘤切片（右）的免疫熒光照片

其余的鼠表型主要在mTECs中檢測到（圖5C和S5F）。

新指骨mTEC表型（M12）表達毛細血管和小動脈標記，而激活的動脈mTECs（M13）中觀察到新動脈生成標記上調(diào)。

值得注意的是，只有mTECs，而不是mNECs，表現(xiàn)出以干擾素（IFN）響應和趨化因子的表達為特征的表型，參與免疫細胞募集和血管阻滯（M14）（圖S5C）。

確定了以前無法識別的EC表型，作者將其稱為突破細胞（M15），以及它們的推定前體，先裂解細胞（M16）（圖5E－5G）。

突破細胞不僅上調(diào)TEC末端標記的表達，而且還上調(diào)VEGF誘導的足突玫瑰花介導的基底膜（BM）和膠原蛋白重塑的基因的表達。

免疫染色證實了蛋白質(zhì)水平上的動脈，毛細血管，靜脈和tipmNEC和mTEC表型的標志物表達（圖S6C–S6J）。

在培養(yǎng)的hcTEC中，體內(nèi)的動脈，毛細血管和靜脈EC表型不再可檢測到（圖S7A和S7B）。

圖S7：A：培養(yǎng)的hcTEC的聚類情況 

B：標記基因在不同亞組中的表達熱圖

在hcTECs中可檢測到典型的tipEC表型（C1），這是一種可塑瞬時表型（plastic transient phenotype ）。

如在培養(yǎng)中的EC繁殖中所預期的，檢測到了增殖的hcTEC（C2）。可能與培養(yǎng)條件有關(guān)（存在轉(zhuǎn)化生長因子b，血清中內(nèi)皮－成纖維細胞轉(zhuǎn)化的誘導劑）

鑒定到表現(xiàn)出內(nèi)皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征的表型（C3）（TAGLN，SERPINE1，F(xiàn)N1，CD44，）。

檢測到一個上調(diào)核糖體基因的中間過渡表型（C4），表明EC表型正在采用另一種表型（圖S7B）。

４．VEGF阻斷劑對TEC表型差異敏感性的影響

使用mTEC分類法，作者探討了特定的EC表型是否對抗VEGF AAT敏感（VEGFR2抗體［DC101］，VEGFR酪氨酸激酶抑制劑［PTK787］）（圖5H）。這些化合物的劑量都達到抑制病理性血管生成并減少腫瘤中的EC數(shù)量的并抑制腫瘤的生長水平（圖S7C）。

圖5H：不同藥物治療后mTEC表型的相對組成

圖S7：治療后的腫瘤重量比較

對照和AAT處理后的EC依舊有相同的cluster組成（圖5H），表明AAT不會改變不同EC表型的整體轉(zhuǎn)錄組特征。

對單個EC表型的量化顯示，tip 和突破TECs最敏感。毛細血管后靜脈和增殖的TEC對VEGF阻滯較不敏感，而毛細血管TEC對PTK787治療較不敏感（圖5H），尚不清楚這是否是由于腫瘤從血管發(fā)芽轉(zhuǎn)變?yōu)檠�管選擇所導致的。

5．腫瘤血管紊亂的分子特征和VEGF阻斷的作用

腫瘤血管結(jié)構(gòu)混亂且功能異常，但缺乏詳細的無偏分子足跡分析。傳統(tǒng)上，AAT被認為可以修剪血管生成的EC，VEGF阻斷療法也被認為可以使異常的血管系統(tǒng)正常化。

作者探討了抗VEGF治療是否通過誘導更細微的基因表達變化來達成EC阻滯作用：

首先通過在成對差異分析中比較血管生成和非血管生成的表型來構(gòu)建“正�！焙汀澳[瘤血管紊亂”的基因特征，以鑒定差異表達的基因（經(jīng)校正的p值＜0．01，｜FC｜＞1．5）。比較發(fā)現(xiàn)分別有18個和28個基因的表達水平顯著升高，分別處于紊亂（tip，突破和未成熟的EC標記基因）和正常（包括毛細血管標記基因）表型中（圖5I，5J，S7D和表S4）。

圖5：I：18個紊亂基因signature在不同處理組的表達水平 

J：紊亂基因signature中的基因的表達水平（黑色虛線左側(cè)）和正常的signature（黑色虛線右側(cè)）的表達水平，藥物處理對這些特征的影響

使用18個紊亂基因signature的GSVA顯示，腫瘤血管的紊亂被VEGF阻斷部分逆轉(zhuǎn)（圖5I和5J）。

圖S7E－F：藥物影響后的基因改變GSVA分析

兩種VEGFR抑制劑均降低了末端EC基因signature的表達（糖酵解；BM重塑）

同時增加了與成熟的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能相關(guān)的signature的表達（抗原呈遞，屏障， 和血管發(fā)育）（圖S7E和S7F）。

因此，VEGF阻斷不僅修剪，而且還調(diào)節(jié)了TECs以促進具有穩(wěn)態(tài)功能的更靜態(tài)和成熟的腫瘤脈管系統(tǒng)，表明部分腫瘤血管分子正�；�。

6．保守的TEC表型和tip EC標記物的鑒定

先前的研究發(fā)現(xiàn)，替代性促血管生成信號的上調(diào)會使抗VEGF療法的療效受到耐藥性的限制。

為了確定備選的血管生成候選物，作者假設(shè)跨物種和模型保守的TEC表型以及一致表達的基因可能是更穩(wěn)定的血管生成候選物。

因此，作者進行了整合的單細胞轉(zhuǎn)錄組學，本體多組學和轉(zhuǎn)錄組學薈萃分析，以識別此類候選基因（圖S8A）。

圖S8A：整合分析流程

作者使用scRNA－seq數(shù)據(jù)來評估跨物種和模型的血管生成EC表型的相似性，使用標記基因集的成對Jaccard相似系數(shù)并應用主成分分析（PCA）進行可視化（圖6A和S8A）。

圖6A：針對跨物種的EC主成分分析

在體外，hcTECs失去了體內(nèi)動脈，毛細血管和靜脈的表型。體內(nèi)hTECs和mTECs和末端EC轉(zhuǎn)錄組signature在培養(yǎng)的hcTEC中是保守的。

僅在培養(yǎng)的和小鼠的TEC以及某些NSCLC患者的hTEC中檢測到具有增殖特征的EC。

新鮮分離的人靜脈和鼠類未成熟TECs，以及中間的hcTECs高度表達核糖體基因，提示可塑性表型，并過渡到其他血管生成EC表型。

除了tip TEC ，其他表型都是模型或物種特異性的。由于tip TEC在所有測試的物種和模型中均表達了相似的標記基因標記，因此作者著重于確定一致的tip TEC標記。

為了構(gòu)建tip TEC標記的排名列表，作者首先選擇了296個保守的tip EC中富集的基因，這些基因在物種和模型的tip TEC中始終表達最高。

其次，對于每個保守基因，作者通過計算3個數(shù)據(jù)集中的每個標記基因等級的乘積來定義等級得分（在此列表中，始終在tip EC中上調(diào)最高的基因中的基因排名最高）（圖 6B）。

圖6B：保守的tip EC標記基因的一致性得分條形圖 

上圖：按指示的生物學過程分類的50個排名最高的標記基因 

下圖：它們與基準數(shù)據(jù)集的交集

作者提取了在排名前50位的富集signature進行后續(xù)分析。

這些富集的signature包含了先前在tipEC中檢測到的tip EC標記（ANGPT2，APLN，F(xiàn)SCN1，PGF，PLXND1，ADM，PDGFB，CXCR4等），但不一定在表達模式和功能水平上進一步表征。

50個排名最高的基因中有一半以前沒有被描述為tip TEC標記（在腫瘤或生理性血管生成中EC的轉(zhuǎn)錄組學研究中未檢測到）。

一致的末端TEC標記與遷移的末端EC表型相關(guān)，包括層粘連蛋白（LAMA4，LAMC1，LAMB1），基質(zhì)細胞蛋白（SPARC，LXN），細胞骨架相關(guān)基因（VIM，MARCKS，MYH9，MYO1B）和細胞粘附分子（CD93，  MCAM，ITGA5）。

確定了新的tip TEC豐富的轉(zhuǎn)錄因子（TCF4，SOX4，SMAD1）。

腫瘤中紊亂的血管結(jié)構(gòu)阻礙了tipTEC的形態(tài)學鑒定：圖S6J（見上）顯示了tip EC標記物的異質(zhì)表達，但標志物在腫瘤血管發(fā)芽的最前端及其在形態(tài)學tip EC中的表達不能被明確鑒定。

因此，作者使用了產(chǎn)后視網(wǎng)膜血管生成模型來驗證LXN（Latexin）和FSCN1（Fascin）在血管前端的tipEC中的表達（圖S8B）。為了證明其功能作用，作者研究了沉默這些tip細胞標記是否會影響tip細胞競爭能力。

圖S8B：出生后第5天，固定物異凝集素B4染色指示脈管系統(tǒng)及LXN或FSCN1的免疫染色

作者沉默了人臍靜脈EC（HUVEC；＞ 70％–80％的沉默效率；圖S8C）中的LXN（ ［shRNA］敲低）或FSCN1（siRNA沉默）表達，并生成了包含1：1對照野生型HUVEC（紅色）、FSCN1（綠色）和被LXN沉默的HUVEC混合物的鑲嵌球體。沉默的細胞很少出現(xiàn)在尖端位置，這證實了這些標記物在tip EC中的作用（圖6C和6D）。

圖6C－D：C：LXNKD D：FSCN1 

照片：EC橢球的代表性顯微照片 右：對具有指定基因型的tip細胞的分數(shù)進行定量7．綜合分析強調(diào)膠原蛋白修飾參與血管生成的作用

編碼膠原蛋白（COL4A1，COL4A2，COL18A1）的基因在最一致的tip EC標記中排名前10位，而其他膠原蛋白修飾（交聯(lián)）酶（PXDN，PLOD1）則排名前50位（圖6B，見上）。

對13名獨立的NSCLC患者進行bulk RNAseq和驗證性RT－PCR分析表明， TECs中參與膠原蛋白交聯(lián)及羥化水平的基因（LOXL2PLOD1－3）表達高于NECs（圖6E和6F）。

圖6E－F：通過（E）bulk－RNAseq或（F）qRT－PCR的編碼膠原羥基化和交聯(lián)酶的基因的表達水平

為了探討其他腫瘤類型的TECs中膠原修飾酶是否上調(diào)，作者對來自五種癌癥患者的bulk RNAseq公開數(shù)據(jù)集中的NEC與TEC進行了整合分析。

在此分析中，編碼膠原蛋白修飾酶的轉(zhuǎn)錄物同樣被富集（對于所有基因，p ＜0．05），并排在TEC中最一致上調(diào)的基因的前1％–5％之間（圖6G）。

圖6G：排位與富集得分圖