前言

臨床成功的ADCs的設計不僅取決于有效載荷的效力及其附著點、連接子的穩(wěn)定性和有效的藥物釋放，而且還取決于抗體和生物偶聯技術的選擇。在過去10年中，所有經FDA批準的ADC都是以ADC的異構混合物的形式存在，單抗的不同位置上附著著不同數量的藥物。偶聯位點對ADC穩(wěn)定性及其藥代動力學具有顯著的影響，高DAR（藥物抗體比）常常導致血漿清除迅速，而低DAR的ADC則表現出的活性較弱。在ADC的藥物中，裸單抗的存在是一種有效的競爭抑制劑。因此，在過去十年中，人們開發(fā)了一大批新的偶聯策略，目的是控制小分子藥物的位置和數量，同時保持結構完整性和同質性。

基于化學的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結構為生物偶聯提供了多種可能性，基于化學的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復雜性，以及在細胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯位點根據抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經FDA批準的ADC，直到2021年，都利用這些內源性氨基酸進行偶聯。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產過程中，FC區(qū)域的翻譯后修飾所導致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯替代方法。

與內源性氨基酸的偶聯

最常見的偶聯方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團與利克有效載荷上親電的N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發(fā)生反應。盡管反應簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導致了許多ADC在隨機分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物／抗體化學計量比的控制，該方法得到廣泛應用，包括已獲批的ADC，如Besponsa， Mylotarg， 和Kadcyla。

最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機輔助設計，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質序列上對單個賴氨酸殘基進行修飾。

反應的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預測，pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應。該技術已應用于5種不同的蛋白質和曲妥珠單抗，在偶聯后均保留了原有的二級結構和蛋白質功能。

2018年，Rai等人報告了另一種利用“化學關鍵蛋白”的可逆分子間反應進行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團，這些官能團在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應。因此，在生理條件下，關鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結合標記抗體。

這種關鍵蛋白的定向修飾技術后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標記技術，即使在存在N－末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1－間隔子－Fk2試劑。

Fk1官能團與賴氨酸可逆反應，調節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進行偶聯，間隔子的設計調節(jié)偶聯的位置。該方法已成功應用于ADC（trastuzumab－emtansine）的合成，證明其細胞活性與已獲批準的Kadcyla相當。

Merlul等人最近報道了一種不同的結合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機金屬鉑（II）的連接子，［乙二胺鉑（II）］2＋，圖中表示為Lx。

這種技術基于絡合和偶聯兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴展到類似的碘絡合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術的偶聯產率和選擇性。Cl－Lx－藥物載荷絡合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I－Lx－藥物載荷，從而獲得更高的偶聯產率。這項技術已被應用于ADC藥物的大規(guī)模生產。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經典的生物偶聯途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應，從而產生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯MMAE，DAR＝8的 ADC實例。與經典的賴氨酸偶聯相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據報道，較高的藥物負荷會增加聚集的風險，從而導致高血漿清除率，并降低體內療效。

Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis－sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應活性。它表現出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。

此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯的再橋接技術，其進一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴－（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團，從而實現快速、高效和高產率的偶聯。最近報道了結合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結合更快，顯示出更高的DAR＝4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結構即使在高溫下也表現出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結構也允許選擇性地引入不同的功能基團。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產生穩(wěn)定的DAR＝4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯效率。他們的工作擴展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經典馬來酰亞胺偶聯相關的體內不穩(wěn)定性的缺點，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基惡二唑，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應。與血漿中的半胱氨酸－馬來酰亞胺偶聯物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設計了DiPODS試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯相比，以這種方式偶聯具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內性能。

聚糖偶聯

由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個重鏈的CH2結構域N297位置包含一個N－聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠距離定位降低了在偶聯后損害抗體的抗原結合能力的風險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯位點。

聚糖生物偶聯可根據用于靶向碳水化合物的技術來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉移酶處理、內糖苷酶和轉移酶處理后的酮或疊氮化物標記。

Neri等人報道了在IgG抗體的N－糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯氨的連接子反應的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6－硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學位點來實現位點特異性結合。與經典半胱氨酸偶聯物相比，這種方法顯著降低了異質性水平，并產生具有更可預測的藥動學和藥效學特性的偶聯物。

重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經證明，利用半乳糖基和唾液酸轉移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯帶羥胺基團的連接子－有效載荷。所得的偶聯物具有較高的靶向選擇性，體內抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結合。

除這些偶聯策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β－ 1，4－半乳糖轉移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團的半乳糖，這種具有雙正交官能團的半乳糖衍生物為高效偶聯開辟了途徑。這些技術已被開發(fā)用于成像和抗癌應用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現的內糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N－聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結構均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應用于trastuzumab－maytansine，制備出具有良好體外和體內藥效的糖偶聯ADC。